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測(cè)定人血漿中25-OH-VD2 和 25-OH-VD3含量的檢測(cè)方法
更新時(shí)間:2018-12-03   點(diǎn)擊次數(shù):6669次

 

說(shuō)起補(bǔ)鈣,營(yíng)養(yǎng)專(zhuān)家認(rèn)為:生長(zhǎng)期、孕期、更年期、老年期要補(bǔ) ,鈣的補(bǔ)充是一種常態(tài),而且會(huì)貫穿人一生。每個(gè)人都需要補(bǔ)鈣,但是大部分時(shí)候,我們只需通過(guò)日常飲食就可以獲取所需的鈣元素。而那些真正需要額外補(bǔ)充鈣劑的,多是處于青春期、孕期、更年期、老年期這些階段的人群。

 

鈣能不能吸收和維生素D是否缺乏有關(guān)

我們補(bǔ)鈣的目的是為了骨骼的健康,從口服鈣到沉積在骨骼上的幾個(gè)環(huán)節(jié)都需要維生素D參加。維生素D是骨骼健康的重要指標(biāo),主要功能是維持人體內(nèi)鈣的代謝平衡以及骨骼形成。研究表明維生素D缺乏會(huì)引起一系列疾病,與人體免疫功能異常、心血管疾病、代謝性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤等密切相關(guān)。由于公眾增加關(guān)注維生素D缺乏對(duì)于身體健康的影響,在過(guò)去的幾年內(nèi),樣品數(shù)量檢測(cè)大大增加。

 

維生素D (Vitamin D) 是類(lèi)固醇的衍生物,又可分為維生素D2(麥角鈣化醇)和維生素D3(膽鈣化醇)。維生素D2體內(nèi)無(wú)法產(chǎn)生,來(lái)自于飲食攝取,多含于植物性食物中,它是由植物的麥角固醇經(jīng)陽(yáng)光照射而合成的。人體皮下儲(chǔ)存有從膽固醇生成的7-脫氫膽固醇,受紫外線的照射后,可轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素D3,也可從強(qiáng)化奶或其他肉類(lèi)食物中獲得。

 

所以臨床對(duì)25-羥維生素D的濃度監(jiān)測(cè)具有非常重要的意義,評(píng)估維生素D營(yíng)養(yǎng)狀態(tài),協(xié)助對(duì)高鈣血癥、骨質(zhì)疏松癥、佝僂病、甲狀旁腺亢進(jìn)和25羥化缺陷等疾病的臨床診斷,指導(dǎo)臨床醫(yī)生對(duì)心血管疾病、自身免疫病、糖尿病和某些藥物的治療與補(bǔ)充。

 

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,人體血中25-羥維生素D營(yíng)養(yǎng)判斷標(biāo)準(zhǔn)如下:

 

目前常用的檢測(cè)25-羥維生素D含量的方法有競(jìng)爭(zhēng)性蛋白結(jié)合法(CPBA)、放射免疫法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法(CLIA)、液相色譜法(HPLC)等。這些方法大部分耗時(shí)、步驟冗雜,無(wú)法滿足臨床簡(jiǎn)便、高通量的要求;并且血液中 維生素D濃度太低,檢測(cè)限達(dá)不到要求。

 

這次我們?nèi)耘f使用明星產(chǎn)品SOLA HRP對(duì)血漿樣品進(jìn)行預(yù)處理,使用Syncronis C18色譜柱保留分離VD,建立了測(cè)定人血漿中25-OH-VD2 和 25-OH-VD3含量的檢測(cè)方法。

 

前處理步驟:

10mg 2mL SOLA HRP 96 孔板

(PN:60309-001)

活化

500℃甲醇,500μL 含2% 甲酸的水

上樣

200μL 血漿

清洗

200μL 含水/ 甲醇(60:40)

洗脫

200μL 甲醇2 次

40℃氮?dú)獯蹈珊笥盟?

乙腈定容到100μL

 

LC方法:

色譜柱:

Syncronis C18 1.7μm 50×2.1 mm

(PN:97102-052130)

流動(dòng)相:

A: 水+0.1% 甲酸

B: 乙睛+0.1% 甲酸

梯度方法:

2min 內(nèi),70-100%B

流速:0.8mL/min

柱溫:40℃

進(jìn)樣量:50μL

 

靈敏度:

LOQ 5ng/mL

 

線性范圍:

血漿中25- 羥基Vit D2 和25- 羥基Vit D3在5 -1000ng/mL 濃度范圍成線性,r2=0.9968 和0.9981

 

回收率結(jié)果:

血漿樣品添加25-OH Vit D2 和25-OH Vit D3 的回收率>94%,RSD<4.0%。

 

體內(nèi)維生素D濃度的準(zhǔn)確定量是診斷維生素D缺乏相關(guān)疾病診斷和治療反饋效果的重要指標(biāo)。采用SOLA HRP對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理,Syncronis C18液相色譜柱保留,所得25-OH-VD2 和 25-OH-VD3的LOQ、標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率均符合臨床檢測(cè)要求,具有非常高的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性,適用于血漿基質(zhì)中維生素D臨床樣本的快速檢測(cè)。

 

后小編啰嗦一句,體內(nèi)維生素D的水平,決定每個(gè)人補(bǔ)充維生素D的利弊。我們不推薦沒(méi)有任何理由地普遍補(bǔ)充維生素D。

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